Праймеры – искусственно синтезированные олигонуклеотиды, идентичные соответствующим участкам ДНК-мишени.
Имеют, как правило, размер от 15 до 30 нуклеотидов (при меньшем/маленьком размере происходит неспецифическое распознавание ДНК)
Для проведения амплификации гена в простейшем случае требуются следующие
компоненты:
- ДНК-матрица, содержащая тот участок ДНК, который требуется амплифицировать.
- Два праймера, комплементарные концам требуемого фрагмента.
- Термостабильная ДНК-полимераза — фермент, который катализирует реакцию полимеризации ДНК.
Полимераза для использования в ПЦР должна сохранять активность при высокой температуре длительное время, поэтому используют ферменты, выделенные из термофилов — Thermus aquaticus (Taq-полимераза), Pyrococcus furiosus (Pfu-полимераза), Pyrococcus woesei (Pwo-полимераза) и другие.
- Дезоксинуклеотидтрифосфаты (dATP, dGTP, dCTP, dTTP).
- Ионы Mg2+, необходимые для работы полимеразы.
- Буферный раствор, обеспечивающий необходимые условия реакции — рН, ионную силу раствора. Содержит соли, бычий сывороточный альбумин.
https://ru.wikipedia.org/wiki/Амплификация_(молекулярная_биология)
Выделенную (очищенную?) молекулу ДНК нагревают, затем она распадается на две нити.
Добавляют праймеры.
Затем смесь ДНК и праймеров охлаждают. При этом праймеры, при наличии в смеси ДНК искомого гена, связываются с его комплементарными участками.
Далее к смеси ДНК и праймера добавляют ДНК-полимеразу (белок/фермент-катализатор) и нуклеотиды (из них получаются новые основания ).
Устанавливают температуру, оптимальную для функционирования ДНК-полимеразы (37 °С).
В этих условиях, в случае комплементарности ДНК гена и праймера,
происходит присоединение нуклеотидов к З'-концам (=один из двух концов цепочки, конкретный) праймеров,
в результате чего синтезируются две копии гена (две - потому что по одной копии для каждой из двух нитей, на которые распалась ДНК).
после этого цикл повторяется снова, при этом количество ДНК гена будет увеличиваться каждый раз вдвое.
(цикл чего? изменения температуры? это было бы логично - нагрели - гены поотделялись, их надо как-то отфильтровать? охладили - праймеры снова приклеились к ДНК (а почему ген не приклеится и не снизит выход продукта?) пошел по новой синтез гена.)
пример типового описания (там 900 - это 90 градусов):
http://www.eforsib.ru/bioins-21-1.html
Реакция амплификации с единичным праймером (single primer amplification reaction, SPAR) [лат. re- — приставка, обозначающая повторность действия или противоположное действие, и actio — действие; лат. amplificatio — распространение, увеличение; англ. primer — запал, затравка] — техника генотипирования, основанная на проведении амплификации ДНК с помощью ПЦР) с использованием не двух, а только одного праймера.
ген - это кусок ДНК от выбранного участка до кодона-терминатора
несущий какую-либо целостную информацию — о строении одной молекулы белка (или одной молекулы РНК)
В обычном процессе длина копируемых ДНК-участков составляет не более 3000 пар оснований (3 kbp). С помощью смеси различных полимераз, с использованием добавок и при определённых условиях длина ПЦР-фрагмента может достигать 20-40 тысяч пар нуклеотидов. Это всё равно значительно меньше длины хромосомной ДНК эукариотической клетки. Например, геном человека состоит примерно из 3 млрд пар оснований.
Отредактировано Лис (2017-05-25 03:26:39)